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The ISME Journal (2023)Cite este artículo

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Los patógenos bacterianos y los virus son las principales causas de enfermedades transmitidas por el agua a nivel mundial. Aquí, descubrimos un interesante paradigma natural de “autopurificación” del agua a través de interacciones entre virus y patógenos a lo largo de un continuo de 1432 km a lo largo de la Ruta Media del Canal de Desvío de Agua Sur-Norte (MR-SNWDC) en China, el canal de agua más grande. proyecto de transferencia en el mundo. Debido al contenido extremadamente bajo de fósforo total (TP) (ND-0,02 mg/L) en el MR-SNWDC, todo el canal ha experimentado una limitación duradera de fósforo (P) desde su funcionamiento en 2015. Basado en 4443 metagenomas ensamblados genomas (MAG) y 40,261 unidades taxonómicas operativas virales (vOTU) no redundantes derivadas de nuestra reciente campaña de monitoreo, descubrimos que los virus residenciales que experimentaban restricciones extremas de P tuvieron que adoptar estrategias adaptativas especiales al albergar genomas más pequeños para minimizar la replicación de nucleótidos, la reparación del ADN y la postraducción. costos de modificación. Con la disminución del suministro de P aguas abajo, los patógenos bacterianos mostraron una capacidad ambiental y un potencial de crecimiento reprimidos, y una capacidad debilitada para mantener la adquisición de P, la formación de membranas y la biosíntesis de ribonucleótidos. En consecuencia, los efectos únicos de depredación viral bajo la limitación de P, caracterizados por infecciones líticas virales mejoradas y una mayor abundancia de genes de ribonucleótido reductasa (RNR) vinculados a los ciclos de replicación del ADN nuclear viral, condujeron a riesgos para la salud inesperadamente menores debido a los patógenos bacterianos transmitidos por el agua en el agua río abajo. -áreas receptoras. Estos hallazgos resaltaron el gran potencial de la autopurificación del agua asociada con la dinámica virus-patógeno para mejorar la calidad del agua y la gestión sostenible de los recursos hídricos.

Los patógenos bacterianos son poblaciones de riesgo que se propagan en diversos entornos, mientras que los virus muestran la interacción más diversa y frecuente como competidores y depredadores naturales de estos patógenos. Los estilos de vida virales típicos incluyen ciclos de infección lisogénica, lítica y crónica [1], con virus virulentos que contribuyen a la lisis inmediata del huésped [2] y virus templados que integran genomas en las células del huésped durante el período lisogénico [3]. Como la replicación y el ensamblaje viral dependen en gran medida de los huéspedes para obtener nutrientes y energía, las interacciones frecuentes entre células y virus en condiciones de limitación de nutrientes, particularmente en ambientes restringidos por fósforo (P), podrían regular la dinámica de la población de patógenos y, en consecuencia, afectar la calidad del agua en los ecosistemas acuáticos.

Grandes repertorios de microbios acuáticos exhiben dinámicas sensibles asociadas con múltiples señales ambientales. Los cambios en la temperatura, el pH y el contenido de nutrientes actúan como fuentes de selección natural para especies con alta adaptabilidad y dan como resultado una fluctuación de alto nivel en la composición de la comunidad [4]. Nutrientes como el P y el nitrógeno (N) son los principales factores limitantes del crecimiento de los microbios fototróficos y podrían afectar aún más la productividad de los heterótrofos a través del circuito microbiano [5]. En teoría ecológica, la ley del mínimo de Liebig implica que el potencial de crecimiento de los microorganismos puede depender de qué nutriente es el más limitante [6]. Se proporcionan tres valores de referencia para el límite oligotrófico de N o P en función de las combinaciones de concentración de N total (TN) y P total (TP), incluidos los criterios de Dodd (TP < 0,025 mg/L, TN < 0,7 mg/L). , el estándar de calidad del agua del Reino Unido (TP < 0,02 mg/L, TN < 1,5 mg/L) y el estándar de calidad del agua de Noruega (TP < 0,02 mg/L, TN < 0,6 mg/L) [7, 8]. Las fracciones de nutrientes (especialmente la relación N:P) también ayudan a definir las limitaciones nutricionales en entornos particulares. Por ejemplo, la proporción de Redfield de N:P proporciona una proporción estequiométrica de nutrientes "óptima" (16:1) como referencia para el fitoplancton marino y de agua dulce. Dado que no se ha alcanzado un consenso sobre la proporción estequiométrica de nutrientes ideal para las bacterias, la proporción de Redfield se ha utilizado aproximadamente para inferir posibles condiciones limitadas por N o P [9]. Algunas regiones oceánicas de gran preocupación limitadas por P mostraron relaciones N:P más altas que el valor de Redfield según los datos de seguimiento de series temporales a largo plazo, por ejemplo, en el Mediterráneo oriental (~28:1), la serie temporal del Atlántico de las Bermudas Sitio de estudio (>24:1) y la estación ALOHA en el giro subtropical del Pacífico Norte (16:1–25:1) [10,11,12]. Además, Schanz y Juon consideran la relación N:P de 20:1 como un valor de referencia para determinar las condiciones limitadas de P en agua dulce [13]. Guildford y Hecky propusieron que la limitación de P sólo ocurre cuando la relación N:P excede 22,6 en los ecosistemas lacustres [14]. Una investigación a macroescala de cientos de lagos en los EE. UU. mostró una relación N:P promedio de ~54:1 en lagos con P limitado [15]. En los últimos años, también se han observado proporciones más altas de N:P en los grandes ríos del mundo, por ejemplo, el río Yangtze (~53:1), el río Han (~65:1) y el río Po (~100:1). [16,17,18]. El P es de fundamental importancia para la síntesis de ATP, ácidos nucleicos, fosfolípidos y otras biomoléculas clave [19]. La disminución de la disponibilidad de P puede afectar la biogénesis de la membrana citoplasmática, provocando alteraciones de la homeostasis iónica y cambios en la morfología celular [20]. Además, la deficiencia duradera de P podría causar una represión severa de los procesos celulares básicos, incluida la fijación de carbono, la replicación del ADN y la biosíntesis de proteínas [21], e incluso inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis.

En los sistemas naturales, el espectro de los ciclos de infección viral está estrechamente asociado con el suministro de nutrientes y la disponibilidad del huésped [22]. Dos hipótesis divergentes dentro del marco de la ecología viral reflejan los complejos escenarios en los que los entornos seleccionan infecciones más líticas o lisogénicas. De manera análoga al modelo clásico de Lotka-Volterra para explicar la dinámica de las poblaciones de depredadores y presas [23], la teoría de "matar al ganador" propone un escenario en el que los virus líticos se aprovechan preferentemente de los huéspedes más predominantes para la reproducción de comunidades virales [24 ]. Por el contrario, la teoría de "llevar a cuestas al ganador" defiende la aparición prevalente de lisogenia con el florecimiento de alto nivel de fuentes huésped como estrategia para que los virus lisogénicos se adapten a los estímulos ambientales [25]. La controversia asociada con los estilos de vida virales resalta las complicadas interacciones virus-huésped bajo diferentes estados tróficos [22]. Estudios previos sobre ecología viral asumieron que la lisogenia ocurría con mayor frecuencia en intestinos y suelos humanos [26, 27], mientras que la lisis era más frecuente en desiertos fríos y aguas oceánicas oligotróficas [28, 29], estrechamente asociada con la productividad microbiana y la transmisión de virus a virus. proporciones de huéspedes [3]. En condiciones de limitación de P, los virus tienden a sufrir ciclos altamente líticos para suprimir la proliferación del huésped o adoptar una manera templada para coexistir con los huéspedes. Durante el período de infección, los virus muestran el potencial de modificar el estado metabólico del huésped mediante la actividad de genes metabólicos auxiliares (AMG) [30]. En las regiones con bajo contenido de P, los virus han evolucionado para contener AMG implicados en la adquisición de P, que aumentan la utilización de P y los procesos metabólicos de P dentro de las células huésped a favor de la autoadaptación y la capacidad de supervivencia [31].

Los patógenos pueden ingresar al cuerpo humano a través de la exposición directa, el agua potable o la cadena alimentaria, causando enfermedades graves como la tuberculosis, el cólera y la fiebre tifoidea [32]. La detección de patógenos convencional depende del cultivo microbiano y la identificación bioquímica [33], caracterizados por un ciclo de prueba largo y una operación complicada. Los métodos basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como enfoque alternativo de detección de patógenos, pueden apuntar solo a especies patógenas limitadas debido al diseño específico de los cebadores de PCR y los procesos de validación [34]. Con la creciente necesidad de alerta temprana y evaluación oportuna de los riesgos de transmisión de patógenos en sistemas relacionados con el agua [35], la secuenciación metagenómica se ha aplicado ampliamente en la vigilancia de la calidad del agua para la detección rápida de patógenos a gran escala [36, 37]. En particular, los genomas ensamblados en metagenomas (MAG) proporcionan recursos fundamentales para explorar la ecofisiología, la dinámica microbiana y las funciones de los microbios no cultivados, incluidos los patógenos bacterianos [38].

La Ruta Intermedia del Canal de Desvío de Agua de Sur a Norte (MR-SNWDC) es el proyecto de ingeniería de transferencia de agua entre cuencas artificiales más grande del mundo para resolver la escasez de agua en el norte de China [39]. Desde el funcionamiento del MR-SNWDC en 2015, la seguridad de la calidad del agua se ha convertido en una preocupación pública importante, principalmente en relación con los componentes de la calidad del agua, los nutrientes, las algas, la diversidad microbiana y otros impulsores ecológicos [40]. En el relativamente cerrado MR-SNWDC, la deficiencia duradera de P y la disminución de P aguas abajo impactaron fuertemente la dinámica viral/patógena y, en consecuencia, afectaron la seguridad de la calidad del agua. Basándonos en metagenomas secuenciados muestreados a lo largo de todo MR-SNWDC, perfilamos los patrones biogeográficos de virus/huéspedes, así como la distribución espacial y las condiciones de crecimiento de patógenos bacterianos en primavera y otoño. Además, examinamos múltiples variables ambientales importantes durante nuestra campaña de monitoreo y revelamos que el P era el factor ambiental clave que afectaba a las comunidades virales y bacterianas. Exploramos más a fondo los rasgos ecofisiológicos especiales de virus y patógenos bacterianos bajo inanición de P. Inesperadamente, descubrimos un interesante paradigma natural de “autopurificación” del agua en el MR-SNWDC que se extiende a lo largo de 1432 km, en el que la mejora de la calidad del agua se benefició de los efectos de depredación de las poblaciones virales autóctonas, lo que resultó en una recesión de bacterias patógenas desde aguas arriba hasta aguas abajo a lo largo del canal. Utilizando los 4443 MAG recién recuperados y las 40 261 unidades taxonómicas operativas virales (vOTU) no redundantes, destacamos la importancia particular de la dinámica de infección entre virus y patógenos en condiciones nutricionales extremas en la autopurificación del agua y la protección de los recursos hídricos.

Los registros históricos (2015 ~ 2021) sobre la concentración de TP se derivaron de China South-to-North Water Diversion Co., Ltd. (ver Datos fuente), que se midieron mensualmente en 32 estaciones de monitoreo distribuidas a lo largo del canal de 1,432 km (Fig. S1 ). Para obtener información combinada sobre los componentes abióticos y bióticos, se realizaron campañas de muestreo especiales en los mismos sitios en agosto de 2020 (otoño) y marzo de 2021 (primavera), sin impactos de climas extremos (Tabla S1). La longitud de la red de canales ramificados entre cada par de sitios de muestreo, definida como la distancia dendrítica [41], se calculó utilizando el software ESRI ArcGIS v10.2. La distancia dendrítica acumulada se calculó como la suma de todos los caminos del área de la fuente de agua hasta un sitio de muestreo, que representan los atributos geográficos de los sitios de muestreo. En cada sitio de muestreo, se recolectaron más de 30 litros de agua con botellas estériles de tereftalato de polietileno (PET) de 4,5 litros y se transfirieron al laboratorio a 4 °C. Luego, filtramos las muestras de agua de 30 L a través de membranas de policarbonato de 0,22 μm (Millipore, EE. UU.) utilizando una bomba de vacío multifunción con circulación de agua (SHZ-D (III), Te'er Instrument and Equipment Co., Ltd, Zhengzhou, China). dentro de las 24 h.

Se monitorearon múltiples factores ambientales importantes en cada sitio de muestreo, incluido el pH, la conductividad eléctrica (CE, μs/cm), la turbidez (TUB, NTU), la temperatura (T, °C), el ion fluoruro (F-, mg/L), sulfato (SO42−, mg/L), carbono orgánico total (TOC, mg/L), carbono orgánico disuelto (DOC, mg/L), permanganato (CODMn, mg/L), nitrógeno amónico (NH4+-N, mg/ L), nitrógeno nitrato (NO3−-N, mg/L), nitrógeno total (TN, N disuelto total más N particulado total, mg/L), fósforo total (TP, P disuelto total más P particulado total, mg/L ), y la relación N:P (relación molar de TN a TP, mol/mol). Estos indicadores ambientales regulares son requeridos en los Estándares de Calidad Ambiental para Aguas Superficiales de China (GB3838-2002) [42] o sugeridos por las estaciones locales de monitoreo del agua, que representan las condiciones generales de los nutrientes y la calidad fisicoquímica del agua. La norma GB3838-2002 clasifica la calidad del agua en cinco categorías (Clase I, II, III, IV y V), desde excelente (Clase I) hasta mala (Clase V), con umbrales propuestos de concentraciones mínimas para los componentes fisicoquímicos clave que causarían riesgos de salud. Todos los factores ambientales seleccionados se determinaron con base en los métodos estándar recomendados por el Ministerio de Ecología y Medio Ambiente de China [43]. La concentración de TP in situ se midió mediante análisis de flujo continuo y el método de espectrofotometría de molibdato de amonio (HJ 670-2013) [44].

La extracción del ADN genómico total de las muestras se realizó utilizando el kit FastDNA Spin para suelos (MP Biomedicals, EE. UU.) según los protocolos del fabricante. La concentración de los productos de ADN extraídos se determinó con un fluorómetro TBS-380 (TurnerBioSystems, EE. UU.). La unidad de fluorescencia relativa de cada dilución se comparó con la curva estándar RL para calcular la concentración de ADN en cada muestra. Se empleó un espectrofotómetro NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para detectar la pureza de los productos de ADN extraídos. La integridad de los extractos de ADN se estimó mediante electroforesis en gel de agarosa. Específicamente, el extracto de ADN se añadió a un gel de agarosa al 1% y luego se sometió a electroforesis a 5 V/cm durante 20 minutos para visualizar los fragmentos de ADN separados.

Las bibliotecas de secuenciación fueron generadas por NEXTFLEX Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, Austin, TX, EE. UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La biblioteca de extremos emparejados se secuenció en la plataforma NovaSeq 6000 (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) en Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd (Shanghai, China), utilizando kits de reactivos NovaSeq y pares de 150 pb. Finalmente se obtuvieron las lecturas finales.

Las lecturas secuenciadas de extremos emparejados se controlaron de calidad utilizando TrimGalore v0.6.4 (--stringency 5; -e 0.1; --length 35; --paired; --max_n 0) dentro de metaWRAP v1.2.2 [45]. MEGAHIT v1.1.3 [46] se utilizó para el ensamblaje de novo con una longitud contig mínima de 1500 pb.

Los contigs de cada ensamblaje se agruparon utilizando el módulo de agrupación dentro de metaWRAP v1.2.2 [45] (--metabat2 --maxbin2 –concoct --run-checkm). Los contenedores inicialmente fusionados fueron verificados por el módulo de refinamiento de contenedores y se identificaron como MAG procarióticos con una integridad> 70% y una contaminación <10%. Los umbrales seleccionados de MAG fueron más rigurosos que el nivel de calidad medio basado en los criterios de Información mínima sobre un genoma ensamblado en metagenoma (MIMAG) (integridad ≥ 50 %, contaminación < 10 %) [47], y ayudaron a proporcionar abundante e información sólida en toda la comunidad sobre bacterias residenciales en el MR-SNWDC. Para garantizar la confiabilidad de los resultados, también se realizaron análisis posteriores para genomas de alta calidad (integridad > 90 %, contaminación < 5 %) en paralelo. La asignación taxonómica de cada MAG se realizó utilizando GTDB-Tk [48] basado en la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB, //gtdb.ecogenomic.org) versión 202.

Los contigs virales en cada ensamblaje se identificaron utilizando viralVerify [49], VIBRANT v1.2.1 [50], DeepVirFinder v1.0 [51], PPR-Meta v1.0 [52] y Virsorter2 v2.1 [53]. Las secuencias con puntuaciones > 0,85 y valores de p < 0,05 se conservaron según la herramienta DeepVirFinder. Luego, se aplicó CheckV v0.7.0 [54] para estimar la integridad de todos los contigs identificados con las cinco herramientas. Los contigs que contenían sitios de integración de provirus se procesaron primero para eliminar las regiones de acogida. La selección de supuestos contigs virales se basó en los siguientes criterios: (I) <90% de integridad (calidad baja/media) y longitud de contig ≥ 5 kb; (II) ≥90% de integridad (alta calidad y completa). Los contigs virales identificados en todos los ensamblajes se eliminaron de la replicación y se agruparon con una identidad de nucleótidos (ANI) promedio del 95% utilizando CD-HIT v4.8.1 [55] (-c 0,95; -aS 0,85). Las secuencias representativas no redundantes se denominaron vOTU. Las anotaciones taxonómicas de vOTU se realizaron utilizando geNomad v1.3.0 (//github.com/apcamargo/genomad). Se aplicó BACPHLIP [56] para predecir los estilos de vida de vOTU con genomas completos o de alta calidad.

Todos los MAG se compilaron en contigs combinados. Se aplicó Bowtie2 v2.3.5.1 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2) para crear un índice de vOTU/MAG y realizar un mapeo de lectura contra los vOTU o contigs de MAG. Se utilizaron archivos bam ordenados generados por SAMtools v1.9 (http://samtools.sourceforge.net) para calcular la cobertura entre muestras utilizando CoverM v0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) (modo contig para vOTU y modo genoma para MAG; -m rpkm; --min-read-percent-identity 95; --min-read-aligned-percent 90; --contig-end-exclusion 0; --no-zeros). El valor de cobertura se expresó en forma de valores de lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas (RPKM) [57].

Los vínculos virus-huésped se predijeron mediante tres métodos in silico complementarios, que se basaron en características genómicas distintivas de virus y procariotas a lo largo de sus interacciones a largo plazo [58]. (I) Homología de secuencia de nucleótidos. Durante el proceso de coevolución molecular a largo plazo, los virus y los huéspedes pueden desarrollar muchas señales genómicas compartidas para la exploración de asociaciones entre virus y huéspedes [59]. Se realizaron comparaciones de secuencias entre vOTU y MAG procariotas utilizando BLASTn (≥90% de identidad mínima de nucleótidos, ≤0,001 valor e). (II) Coincidencia de ARN de transferencia (ARNt). Algunos virus pueden mostrar el ajuste de los perfiles de uso de codones para hacer coincidir los genes de ARNt con los de los genomas del huésped bajo estrés evolutivo [60]. Se aplicó ARAGORN v1.265 [61] (opción '-t') para identificar ARNt de MAG y vOTU procarióticos, con alineamientos posteriores utilizando BLASTn para cumplir con los requisitos de 100% de identidad de secuencia y 100% de cobertura de longitud. (III) Coincidencia del espaciador CRISPR. CRISPR representa un mecanismo inmunológico procariótico adquirido para reconocer y memorizar segmentos cortos del genoma del invasor viral [62]. Los CRISPR se identificaron a partir de MAG procarióticos utilizando la versión 0.4.2 picada [63] y luego se compararon con contigs virales mediante BLASTn con una falta de coincidencia ≤1 y una cobertura del 100 %, creando así un vínculo virus-huésped. Los resultados de los tres métodos se combinaron para representar supuestas asociaciones entre virus y huéspedes. Para garantizar la confiabilidad de la predicción del huésped, utilizamos las relaciones virus-host informadas en la base de datos Virus-Host (virus-host DB, disponible en https://www.genome.jp/virushostdb) como controles positivos para eliminar virus taxonómicamente incomparables. ‒vínculos de acogida. Los pares virus-huésped de los virus no clasificados se incluyeron para análisis posteriores ya que no había evidencia suficiente para excluir la posibilidad de asociaciones entre estos virus y sus huéspedes [64]. La construcción de la red bipartita de coocurrencia de los vínculos virus-hospedador se describe en los Métodos complementarios.

Todos los marcos de lectura abiertos (ORF) de MAG se alinearon con la base de datos SARG v2.2 [65] y la base de datos del factor de virulencia (VFDB) [66] utilizando BLASTp con un valor e ≤ 10-5. Una secuencia de proteínas se anotó como gen de resistencia a antibióticos (ARG) o gen de factor de virulencia (VFG) si el mejor resultado mostraba una identidad de aminoácidos ≥ 80% y una cobertura de consulta ≥ 80% [67]. Las MAG procarióticas con VFG se consideraron bacterias patógenas potenciales, y aquellas que portaban tanto VFG como ≥10 copias de ARG se consideraron "superpatógenos" [36].

Las proteínas previstas de MAG y vOTU fueron anotadas por eggNOG-mapper [68] basándose en el conjunto de datos de bacterias en la base de datos eggNOG v5.0 [69], con la opción DIAMOND y un valor e <1e-5. Cada gen anotado fue asignado a un grupo COG específico. La predicción y validación de genes metabólicos auxiliares (AMG) codificados por virus se describen en detalle en los Métodos complementarios.

Los genes de copia única se extrajeron utilizando la herramienta fetchMG [70]. El número de cada gen anotado se dividió por el número promedio de 10 genes universales de copia única (COG0012, COG0016, COG0018, COG0172, COG0215, COG0495, COG0525, COG0533, COG0541 y COG0552) en cada conjunto de datos de muestra, lo que representó el promedio número de copia del gen [71].

Se extrajeron un total de 22.387 secuencias virales con genomas completos de cuatro ecosistemas de aguas superficiales representativos, es decir, aguas residuales, marinos, lacustres y fluviales, en la base de datos IMG/VR [72]. Se seleccionaron las vOTU en MR-SNWDC con longitudes superiores a 5 kb y 100 % de integridad para realizar una comparación imparcial con virus disponibles públicamente. Las diferencias estadísticamente significativas en el tamaño total del armazón, las cantidades de CDS, el contenido de GC y la composición de aminoácidos de los genomas virales en MR-SNWDC y la base de datos IMG/VR se evaluaron utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Wilcoxon corregida por Bonferroni para comparaciones múltiples. . Se proporcionan métodos complementarios adicionales para estimar la relación entre las vOTU en MR-SNWDC y los virus disponibles públicamente en la base de datos IMG/VR.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R 4.1.1 con un nivel de significación de p <0,05 a menos que se indique lo contrario.

Se utilizó una escala multidimensional no métrica (NMDS) para visualizar la distribución espaciotemporal de las comunidades virales y bacterianas según la matriz de disimilitud de Bray-Curtis generada a partir de tablas de abundancia relativa para vOTU o MAG. Las comunidades virales y bacterianas se agruparon geográficamente en cuatro regiones ecológicas desde aguas arriba hasta aguas abajo a lo largo del canal, definidas como Reg 1~4. La importancia de la variación espaciotemporal se estimó mediante análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA).

Las matrices de distancias dendríticas por pares se transformaron en componentes principales de matrices vecinas (PCNM) utilizando la función pcnm en el paquete R "vegano" [73]. Los PCNM 1 ~ 3 resultantes con valores propios positivos se seleccionaron para el análisis posterior. Se aplicó una prueba de Mantel parcial (corregida por PCNM) para estimar las correlaciones entre múltiples factores ambientales y las distancias de Bray-Curtis calculadas a partir de las abundancias relativas de vOTU o MAG. Además, realizamos análisis forestales aleatorios para examinar los principales impulsores ambientales de las comunidades virales y bacterianas. La importancia de cada factor ambiental estuvo representada por el aumento en la pureza del nodo o el aumento porcentual en el error cuadrático medio (MSE), y los valores más altos implican factores más importantes [74]. El nivel de significancia de cada factor ambiental se evaluó en base a 5000 permutaciones utilizando el paquete R “rfPermute” [75]. Además, realizamos un análisis de redes de coocurrencia para examinar la influencia de los factores ambientales en las MAG/vOTU, lo que facilitó la interpretación de las propiedades a nivel de sistema de las comunidades microbianas desde las perspectivas de robustez y modularidad [76]. Las redes se construyeron basándose en las correlaciones de Spearman entre gradientes ambientales y abundancia de MAG/vOTU. Se excluyeron de los análisis los MAG o vOTU con abundancias relativas en todas las muestras inferiores a 0,001. En las redes solo se visualizaron los vínculos con coeficientes de correlación ≥ 0,7 y valores de p ajustados por Bonferroni < 0,05 [77].

Para estimar la dinámica de proliferación de las poblaciones bacterianas desde el área de la fuente de agua hasta las regiones aguas abajo, se definió un factor de crecimiento regional (RGF), análogo al factor de crecimiento local (LGF) previamente definido para las comunidades microbianas [40]. Las abundancias absolutas se promediaron dentro de cada región, con una posterior comparación de las abundancias en las Reg. 2 a 4 y el área de la fuente de agua (Reg. 1), que fue la siguiente:

donde \({{{{{\rm{ABUN}}}}}}_{{{{{\rm{Reg}}}}}}_{x,i}}\) es la abundancia absoluta de MAGi en Regx y \({{{{\rm{ABUN}}}}}_{{{{{{\rm{Reg}}}}}}_{1,i}}\) es la abundancia absoluta de MAGi en Reg 1. Dentro de cada región, las poblaciones bacterianas se clasificaron en cuatro categorías, incluidas las “emergidas” (RGF > 0 y \({{{{{\rm{ABUN}}}}}}_{{{{{ {\rm{Reg}}}}}}_{1,i}} = 0\)), “promovido” (RGF > 0 y \({{{{{\rm{ABUN}}}}}}_ {{{{{{\rm{Reg}}}}}}_{1,i}} > 0\)), “inhibido” (RGF < 0 y \({{{{{\rm{ABUN}} }}}}_{{{{{{\rm{Reg}}}}}}_{x,i}} > 0\)) y “desaparecido” (\({{{{{\rm{ABUN }}}}}}_{{{{{\rm{Reg}}}}}}_{x,i}} = 0\)).

Se derivaron un total de 5,61 Tb de datos metagenómicos de 64 muestras tomadas en 32 sitios de monitoreo a lo largo del MR-SNWDC en primavera y otoño (Fig. S1 y Tabla S1). Las 40.261 vOTU no redundantes (con una longitud promedio de 16,4 kb) de los análisis virómicos se asignaron a cuatro niveles de calidad del genoma, incluyendo completo (1,6%), alta calidad (3,2%), calidad media (4,7%) y baja. calidad (90,5%) (Tabla S2). Una gran fracción de genomas virales de baja calidad apareció en la base de datos IMG/VR [72], el conjunto de datos Global Ocean Virome (GOV) 2.0 [78] y otros conjuntos de datos relevantes de estudios sobre ecología viral [4, 57], lo que refleja la la novedad de los virus ambientales con baja similitud con los genomas virales de referencia actualmente limitados, así como el desafío de ensamblar genomas virales completos utilizando metagenomas de lectura corta. Entre las 30.453 vOTU a las que se asignó una taxonomía putativa, el 99,7 % estaban afiliadas a virus de ADN bicatenario (dsDNA) y 92 vOTU eran virus de ADN monocatenario (ssDNA). Aunque el análisis NMDS mostró una agrupación significativa de la diversidad β viral según el otoño (2020) y la primavera (2021) (p <0,001, Fig. 1A y Tabla S3), es posible que se necesiten más datos de series temporales (N > 2) para respaldar los cambios estacionales en las comunidades virales. Surgieron cuatro regiones ecológicas distintas para la distribución espacial endémica de las comunidades virales (p <0,001, Fig. 1B, C y Tabla S3), definidas como Reg 1 (Embalse Danjiangkou: 01-02), Reg 2 (aguas arriba: 03-18 ), Reg 3 (aguas abajo: 19–28) y Reg 4 (áreas receptoras de agua: 29–32).

Los análisis de escala multidimensional no métrica (NMDS) visualizan la variación temporal de la diversidad β viral (A), así como la división distinta en cuatro regiones ecológicas de comunidades virales en otoño (B) y primavera (C), según la disimilitud de Bray-Curtis. Matriz calculada a partir de las abundancias relativas de vOTU. El valor de tensión denota la aptitud de ordenación de cada parcela NMDS. Cada grupo está rodeado por una elipse con un intervalo de confianza del 95%. Una muestra atípica (06A) se excluye de análisis posteriores. Los gráficos de D Sankey muestran la distribución de vOTU desde el área de la fuente de agua (Reg 1) hasta las áreas receptoras de agua (Reg 4). Las barras de diferentes colores representan la cantidad de vOTU de la región local (aparecieron por primera vez en la región en cuestión pero no se detectaron en el tramo superior de la región). Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Dado que el límite de cemento del canal bloquea en gran medida la conectividad con la escorrentía superficial externa o subterránea, el MR-SNWDC se considera un sistema de flujo unidireccional cerrado ideal con especies microbianas aguas abajo derivadas principalmente del embalse aguas arriba. La diversidad β de las comunidades virales mostró una alta similitud de Sorenson (>0,85) entre las cuatro regiones, lo que indica una alta concordancia en la frecuencia de aparición viral en todo el canal (Fig. S2). Además, la distribución espacial de las poblaciones virales desde aguas arriba hasta aguas abajo demostró que aproximadamente el 75 % de las vOTU en todo el MR-SNWDC se observaron primero en el embalse de Danjiangkou, lo que representa específicamente entre el 75 y el 90 % de la riqueza viral en cada uno de los tres principales en cuestión. -regiones del canal (Fig. 1D). El patrón espaciotemporal de las comunidades virales fue consistente con el de las comunidades bacterianas representadas por 4443 MAG, aunque se mantuvo un equilibrio general de riqueza viral con una pérdida significativa de riqueza bacteriana aguas abajo (Fig. S3).

Durante siete años (2015 ~ 2021), el monitoreo mensual de la calidad del agua proporcionó evidencia de una limitación duradera de P en el MR-SWNDC, con casi todas las concentraciones de TP medidas espacial o temporalmente inferiores al criterio oligotrófico de P de 0,02 mg/L. Según los Estándares de calidad ambiental de China para aguas superficiales (GB3838-2002) [42], el TP observado < 0,02 mg/L significó que la calidad del agua se clasificó como la mejor (Clase I) para fines de agua potable. La concentración de TP promediada anualmente en los últimos tres años (2019 ~ 2021) osciló entre 0,006 y 0,007 mg/L en el MR-SNWDC (Fig. 2A), más baja que la de otros ecosistemas fluviales o lacustres representativos de la Base de datos global de calidad del agua dulce. (Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente, GEMStat, https://gemstat.org/), que cubrió registros de TP en 2015~2021 y al menos un año de datos de monitoreo en 2019~2021 (Tabla S4).

A Concentraciones promedio mensuales y anuales de TP de 2015 a 2021. El área gris muestra la desviación estándar del contenido promedio mensual de TP. B Cambios longitudinales en la concentración de TP a lo largo del canal. Los puntos grises representan la concentración promedio anual de TP durante 7 años. La barra de error corresponde al intervalo de confianza del 95%. Los puntos rojo y azul representan la concentración de TP en los meses de muestreo. Para cada regresión lineal se presentan el valor de bondad de ajuste R2 y la significación estadística (****: <0,0001). C Correlación entre factores ambientales y comunidades virales/bacterianas en otoño y primavera. Los coeficientes de Pearson por pares se indican mediante gradientes de color. El ancho del borde demuestra los coeficientes de correlación r de Mantel. El color del borde representa el nivel de significancia del valor p basado en 999 permutaciones. D Importancia forestal aleatoria de cada factor ambiental para las comunidades virales y bacterianas en dos estaciones. Todos los factores ambientales se clasifican según su índice de importancia representado por el aumento en la pureza de los nodos. La importancia de cada factor ambiental se muestra en asteriscos (**: <0,01; *: <0,05). Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Elementos biológicamente importantes como C, N y P desempeñan papeles fundamentales en las actividades fisiológicas de los microorganismos. Por ejemplo, tanto los heterótrofos como los fotótrofos requieren N y P para los componentes celulares y las actividades enzimáticas, a pesar de su diferenciación en la utilización del carbono y los estilos de vida. En el presente estudio, las concentraciones medidas de TOC y TN se mantuvieron en niveles relativamente estables a lo largo del canal. Sin embargo, el coeficiente de variación (la desviación estándar dividida por la media) de TP fue de 0,48 y 0,39 en otoño y primavera, respectivamente, aproximadamente entre 2 y 5 veces mayor que el de TOC (otoño: 0,12, primavera: 0,11) o TN. (otoño: 0,10, primavera: 0,06), lo que sugiere que el MR-SNWDC era más sensible a P que a C o N. El contenido extremadamente bajo de P (0,008 mg/L en otoño y 0,007 mg/L en primavera) (Fig. 2A) dio como resultado una relación N:P promedio muy alta (~350:1) en relación con el nivel de referencia N:P. (16: 1) de la relación de Redfield (Fig. S4), que indica condiciones de falta de P en el MR-SNWDC. Según los datos de monitoreo de 7 años, la alta relación N:P se mantuvo a largo plazo (290:1~405:1) a lo largo del canal principal (Fig. S5).

Además, la variación espacial en la concentración de TP obtenida de las campañas especiales de monitoreo (agosto de 2020 y marzo de 2021), similar a la tendencia del contenido de TP promediado anualmente a lo largo del canal principal durante siete años, mostró una disminución significativa de 0,010 ~ 0,011 mg/L. en el tramo superior dentro del área de fuente de agua a 0,004 ~ 0,005 mg/L en el tramo inferior cerca de los municipios de Beijing y Tianjin (otoño: R2 = 0,46; primavera: R2 = 0,56) (Fig. 2B). Dado que el sistema cerrado con límite de cemento del canal redujo significativamente la entrada externa de contaminación por P, el principal suministro de P en todo el canal probablemente derivaría de los fertilizantes de fosfato en las cuencas alrededor del área de la fuente de agua (embalse de Danjiangkou) [79] , lo que sugiere tendencias de disminución similares en el nivel de concentración de TP y el flujo de P aguas abajo (Fig. S6) debido a la dilución continua y el consumo microbiano.

Además, empleamos análisis de correlación ambiental, un modelo de bosque aleatorio y análisis de redes de co-ocurrencia para descubrir los principales efectos de TP en comunidades virales y bacterianas en base a 14 indicadores ambientales recomendados por los Estándares de Calidad Ambiental para Aguas Superficiales de China (GB3838-2002) y Estaciones locales de monitoreo de agua. Teniendo en cuenta que la fuente de carbono podría ser un factor limitante del crecimiento más directo para los heterótrofos [80], también realizamos los mismos análisis para las bacterias heterótrofas excluyendo a los fotótrofos (principalmente cianobacterias) de los conjuntos de datos de la comunidad. La prueba parcial de Mantel demostró que TP y la relación N:P estaban altamente correlacionadas con vOTU o MAG tanto en otoño como en primavera (Figs. 2C y S7A). Utilizando el modelo de bosque aleatorio, analizamos la importancia de cada factor ambiental y encontramos que TP fue el factor ambiental más significativo que influyó en las comunidades virales y bacterianas en ambas estaciones (Figs. 2D y S7B). Las comunidades bacterianas en primavera estuvieron altamente influenciadas por la relación N:P, que fue en gran medida un proceso limitado por P ya que el N fue generalmente suficiente y no sensible en el MR-SNWDC. Además, la red de co-ocurrencia de factores ambientales y MAG/vOTU mostró que TP y N:P estaban presentes en el módulo más grande con la mayor cantidad de conexiones a MAG/vOTU en ambas temporadas, lo que sugiere sus efectos dominantes en las comunidades bacterianas y virales ( Figura S8).

En comparación con el tamaño promedio de los 22,386 genomas virales completos bajo un rango de P más amplio en cuatro ecosistemas de aguas superficiales representativos de la base de datos IMG/VR, el tamaño del genoma (valor promedio de 25 kb) de las 646 vOTU con genomas completos (consulte la Tabla S2 ) derivado del ambiente extremo restringido por P en el MR-SNWDC fue aparentemente más pequeño que el de los lagos, ambientes marinos o ríos, y mucho más pequeño que el de las aguas residuales ricas en P (valor promedio de 47 kb) (Fig. 3A). . La concentración de TP para estos biomas públicos seleccionados (si se informa) fue superior a 0,02 mg/L, superior al límite superior del contenido de TP en el MR-SNWDC. El pequeño tamaño del genoma se atribuyó principalmente a la frecuencia de codificación reducida de genes funcionales asociados con la replicación, recombinación y reparación del genoma, así como a la modificación postraduccional, el recambio de proteínas y las chaperonas (Fig. 3B). Además, los virus en condiciones restringidas por P contenían contenidos más altos de guanina-citosina (GC) (Fig. S9A) y residuos de aminoácidos más específicos relacionados con la estabilidad de las proteínas (Fig. S9B) que los de la base de datos IMG/VR, lo que sugiere una situación general. Robustez de las estructuras virales en el MR-SNWDC. La menor proporción de lisina-arginina y el mayor contenido de prolina de los genomas virales en el MR-SNWDC ayudaron a interpretar la aparición mejorada de puentes salinos y enlaces de hidrógeno entre las estructuras proteicas secundarias [81], que sirvieron como el principal impulsor para mejorar la estabilidad viral. La asparagina, la metionina y la tirosina, que están estrechamente asociadas con la flexibilidad del plegamiento de proteínas y generalmente participan en la optimización en condiciones de frío [4], mostraron frecuencias significativamente más bajas en los genomas virales en el MR-SWNDC, lo que sugiere una reducción en los factores de flexibilidad en el moléculas virales. En los Resultados complementarios y en la Fig. S10 se proporciona más información sobre las relaciones entre las vOTU en MR-SNWDC y las secuencias virales informadas públicamente en la base de datos IMG/VR.

Una longitud del genoma de los virus en MR-SNWDC y cuatro ecosistemas de aguas superficiales representativos (fluvial, marino, lacustre y de aguas residuales) de la base de datos IMG/VR. La longitud promedio del genoma viral de cada conjunto de datos está marcada por el punto rojo y se indica en la etiqueta. La diferencia estadística se estima mediante la prueba de Wilcoxon ajustada por Bonferroni. B Cantidades promedio de CDS virales en cada categoría funcional del COG. La prueba de Kruskal-Wallis se realiza para detectar diferencias de CDS virales en la base de datos MR-SNWDC y IMG/VR (que combina cuatro ecosistemas). Todos los niveles de significancia anteriores están marcados con asteriscos (****: <0,0001; **: <0,01; ns: >0,05). Las funciones COG incluyen: A (procesamiento y modificación del ARN), B (estructura y dinámica de la cromatina), C (producción y conversión de energía), D (control del ciclo celular, división celular, partición de cromosomas), E (transporte y metabolismo de aminoácidos). , F (Transporte y metabolismo de nucleótidos), G (Transporte y metabolismo de carbohidratos), H (Transporte y metabolismo de coenzimas), I (Transporte y metabolismo de lípidos), J (Traducción, estructura ribosómica y biogénesis), K (Transcripción), L ( Replicación, recombinación y reparación), M (biogénesis de pared/membrana/envoltura celular), N (motilidad celular), O (modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas), P (transporte y metabolismo de iones inorgánicos), Q (biosíntesis de metabolitos secundarios, Transporte y catabolismo), T (Mecanismos de transducción de señales), U (Tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular), V (Mecanismos de defensa), W (Estructuras extracelulares) y Z (Citoesqueleto). Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Se observó una tendencia general decreciente en la riqueza bacteriana a lo largo del canal con una disminución en la concentración de TP aguas abajo tanto en primavera como en otoño (Fig. 4A), especialmente en otoño. Los MAG bacterianos residenciales (2109) que se originan en el área de la fuente de agua (embalse de Danjiangkou) se redujeron aproximadamente a la mitad en el extremo del canal (áreas receptoras de agua) en otoño. A pesar de la disminución general en el número de MAG con flujo de agua, notamos un ligero aumento en la riqueza bacteriana del Reg 1 al Reg 2, lo que refleja la posible introducción de especies externas provenientes de la escorrentía superficial/subsuperficial en la temporada de lluvias a lo largo del Reg 2 que se extiende ~660 km. . La comparación de la abundancia de bacterias en el canal principal y el área de la fuente de agua reveló una variación proporcional en las poblaciones de bacterias emergidas, promovidas, inhibidas y desaparecidas a lo largo del MR-SNWDC (Fig. 4A, ver "Materiales y métodos"). En ambas temporadas, aproximadamente el 60% de las MAG bacterianas mostraron ciclos de emergencia o floración en Reg 2, seguido de una caída posterior en Reg 3 y Reg 4. La proporción de bacterias desaparecidas fue de 4 a 10 veces mayor en las áreas receptoras de agua que en Reg 2 o Reg 3, correspondiente a la disminución significativa en el suministro de P y fuertes efectos de filtrado ambiental en los patrones de extinción de poblaciones con baja adaptación.

Treinta y dos sitios de muestreo están dispuestos a lo largo de los 1432 km del canal, que se clasifica en cuatro regiones distintas (gráfico superior). La distancia dendrítica acumulada se calcula entre cada sitio de muestreo y el área de la fuente de agua (ver "Materiales y métodos"). Los gráficos de líneas A demuestran cambios en la riqueza de las poblaciones bacterianas representadas por MAG a lo largo del canal, mientras que los gráficos circulares indican una variación proporcional en las bacterias emergidas, promovidas, inhibidas y desaparecidas en tres regiones del canal principal (ver "Materiales y métodos"). B Mapa de calor que muestra el número promedio de copias de genes clave asociados con P codificados por bacterias en los sitios de muestreo. Los paneles superior e inferior representan las temporadas de otoño y primavera, respectivamente. pstS gen de unión al sustrato del sistema de transporte de fosfato, gen inducible por inanición de fosfato phoH, ribonucleótido reductasa RNR (I: nrdABEFHI, II: nrdJ, III: nrdDG, regulador transcripcional TR nrdR), plsX fosfato aciltransferasa, plsY glicerol-3-fosfato aciltransferasa, G6PD glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, 6PGD 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Algunos genes centrales del regulón de fosfato, especialmente el gen pstS de unión al sustrato del sistema de transporte de fosfato y el gen phoH inducible por la falta de fosfato, desempeñan papeles importantes en las actividades de adquisición de P [82]. Estos genes mostraron una disminución notable (R2 = 0,39, p <0,0001) en las frecuencias de codificación a lo largo del canal (Fig. 4B y Fig. S11). Mientras tanto, también se observó una reducción significativa en el número promedio de copias de otros genes clave basados ​​en P en la dirección del flujo, que era esencial para la síntesis de nucleótidos, la replicación del ADN y los procesos de formación de membranas, incluida la vía de las pentosas fosfato (PPP: G6PD, 6PGD ) (R2 = 0,32, p < 0,0001), biosíntesis de fosfolípidos (plsX, plsY) (R2 = 0,46, p < 0,0001) y ribonucleótido reductasa (RNR: RNR I + II + III, regulador transcripcional RNR) (R2 = 0,30, p < 0,0001). Se observaron tendencias similares en riqueza, potencial de crecimiento y variación genética para los genomas bacterianos de alto nivel de calidad (integridad> 90%, contaminación <5%), lo que confirma la confiabilidad de los resultados (Fig. S12). Además de los genes basados ​​en P, investigamos otros genes funcionales asociados con el metabolismo de carbohidratos, energía, nitrógeno, azufre y nucleótidos, y encontramos una disminución constante en el número promedio de copias de estos genes a lo largo del canal (Fig. S13). El suministro extremadamente bajo de P en las regiones aguas abajo puede quedar fuera del rango de contenidos de P en el que las bacterias pueden mantener actividades fisiológicas normales, mostrando así funciones biológicas debilitadas relacionadas con la adquisición de P y otros procesos celulares básicos. La presencia universalmente inhibida de genes asociados a P, así como la riqueza reprimida y el potencial de crecimiento de las bacterias, sugirieron su baja aptitud ambiental bajo la selección impulsada por restricciones de P.

Con base en la predicción in silico y controles positivos utilizando asociaciones conocidas entre virus y huéspedes, el 11,6% del total de 40.261 vOTU se asignaron a huéspedes procarióticos putativos que abarcaban 15 filos bacterianos, en los cuales la mayoría (91,0%) estaban vinculadas a un solo filo huésped pero algunos (0,8%) exhibieron una amplia gama de huéspedes en 3 o más filos (máximo 5) (Fig. 5A y Tabla S5). Estas vOTU asignadas por el anfitrión representaron aproximadamente entre el 60% y el 90% de la abundancia de vOTU totales en todas las muestras. Entre 33.391 enlaces de virus-hospedador emparejados, Actinobacteriota representó la mayor parte en el número de huéspedes (35,6%), seguida de Proteobacteria (33,9%) (Fig. 5A). Entre los virus taxonómicamente conocidos dentro de enlaces validados entre virus y huésped, aproximadamente el 99,9% pertenecía a Caudoviricetes, que representaban los fagos de ADNbc más abundantes, así como 17 fagos de ADNmc (Inoviridae). Para cada filo bacteriano, la abundancia viral mostró una correlación positiva significativa con la abundancia del huésped, lo que sugiere la precisión de los vínculos virus-hospedador identificados (Fig. S14). Las proporciones de abundancia de virus-huésped (VHR) fueron mayores que uno (16,7 ~ 2021,4) para todos los filos bacterianos (Fig. S15). Se visualizaron un total de 4659 vOTU y 3930 MAG en la red de coocurrencia (Fig. S16). Todos los enlaces virus-host se agruparon en 153 módulos separados. Los cinco módulos representativos más grandes mostraron los vínculos más compuestos entre los virus y sus anfitriones, con más de 400 miembros de la comunidad en cada módulo. La coexistencia del huésped y la amplia gama de virus del huésped ayudaron a interpretar las diversas y complejas infecciones cruzadas entre virus y huéspedes en estos módulos. Aproximadamente el 23,5% de los módulos representaban vínculos entre un solo virus y una cepa huésped únicamente.

A Los vínculos entre virus y huésped muestran perfiles de rango de huéspedes virales que abarcan diversos filos bacterianos, con la mayoría de las vOTU vinculadas a un solo filo de huésped y las vOTU menores que exhiben relaciones entre filos (≥2). B La predicción del estilo de vida proporciona la proporción de vOTU (con genoma completo) que adoptan ciclos de infección virulentos o templados. Ambas temporadas son testigos de tendencias crecientes significativas en la relación de abundancia del virus C-huésped (VHR) y la abundancia de genes asociados a RNR codificados por el virus D a lo largo del canal. El valor de bondad de ajuste R2 y la significación estadística se presentan para cada regresión lineal (*: <0,05; ***: <0,001; ****: <0,0001). Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Entre los 1945 virus con genomas completos o de alta calidad, se predijo que aproximadamente el 90% adoptaría un estilo de vida lítico (Fig. 5B). El aumento de los VHR hacia aguas abajo (otoño: R2 = 0,14, p <0,05; primavera: R2 = 0,28, p <0,01) reflejó un nivel elevado de ciclos de infección viral a lo largo del canal (Fig. 5C). Los genes RNR codificados por virus mostraron un aumento significativo en la abundancia promedio a lo largo del canal (otoño: R2 = 0,16, p <0,05; primavera: R2 = 0,44, p <0,0001), consistente con la mejora de la dinámica de la infección (Fig. 5D). y puede estar relacionado con el proceso de replicación del genoma promovido para una rápida garantía reproductiva.

En este estudio, se reveló una gran parte de las AMG codificadas por virus del gen pstS (consulte los Métodos complementarios) para indicar la capacidad de los virus para promover la adquisición de P de las células huésped en condiciones limitadas por P (resaltado en negrita en la Tabla S6 ). Además de la presencia esperada de pstS [31], las anotaciones de DRAM-v proporcionaron información sobre otros AMG altamente enriquecidos asociados con el metabolismo de nucleótidos, incluida la dUTP pirofosfatasa (DUT), la ADN (citosina-5-)-metiltransferasa (DNMT), la dCTP desaminasa (dcd) y timidilato sintasa (thyA), lo que sugiere capacidad viral para facilitar el metabolismo del huésped en relación con la biosíntesis de nucleótidos y la reparación del ADN (Fig. S17A). Además, identificamos 54 AMG como UDP-glucosa 4-epimerasa (galE) capaz de proporcionar el flujo de carbono y los cofactores necesarios para la actividad catalítica basada en nucleótidos. Todos los AMG representativos seleccionados se validaron mediante el modelado de estructuras de proteínas terciarias (Fig. S17B).

El riesgo inducido por patógenos, como uno de los problemas de salud pública del agua potable, es una preocupación importante para la seguridad del agua en MR-SNWDC. Aquí, investigamos la distribución espaciotemporal y el potencial de crecimiento de bacterias patógenas a lo largo del canal. En el área de la fuente de agua (Reg 1), se detectaron inicialmente 387 y 292 patógenos bacterianos en otoño y primavera, respectivamente, lo que representa el 15,3% de todos los MAG, con una disminución general a lo largo del canal desde el embalse de Danjiangkou hasta las áreas receptoras de agua. (Figura 6A). Aunque todo el canal es un sistema controlado artificialmente, las especies patógenas externas a lo largo de la Reg 2 que se extiende ~660 km todavía fueron potencialmente introducidas con escorrentía superficial/subsuperficial en la temporada de lluvias y dieron como resultado un ligero aumento local en la riqueza de patógenos. La proporción de patógenos recientemente surgidos o proliferados disminuyó de Reg 2 (>60%) a Reg 4 (<40%), y el número de patógenos desaparecidos en Reg 4 fue casi diez veces mayor que en Reg 2 (Fig. 6A). Mientras tanto, diez patógenos bacterianos portadores de múltiples ARG, como súper patógenos resistentes a los antibióticos, aparecieron aguas arriba pero casi fueron eliminados en las áreas receptoras de agua (Fig. 6B), lo que sugiere una reducción de los riesgos actuales para la salud que plantean los patógenos resistentes a los antibióticos.

A A lo largo del MR-SNWDC (1432 km) con un suministro de P decreciente, las poblaciones de patógenos bacterianos, representadas por MAG, exhiben tendencias consistentes en la riqueza (gráficos de líneas) y el potencial de crecimiento (gráficos de barras, ver Materiales y métodos) en otoño y primavera. B La red bipartita representa los vínculos entre diez súper patógenos portadores de ARG (ver Materiales y métodos) y sus depredadores virales. Los cuadrados rellenos indican la aparición/proliferación (+) o desaparición (-) de cada superpatógeno específico en tres regiones del canal principal. C Los genes clave codificados por patógenos de cuatro procesos metabólicos, asociados con la adquisición y utilización de P, muestran una disminución significativa en el número promedio de copias a lo largo del canal. D Las proporciones de abundancia de virus y patógenos muestran un aumento notable con el flujo de agua en ambas estaciones. Cada regresión lineal se denota por el valor R2 de bondad de ajuste y el nivel de significancia del valor p. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Con la disminución de la concentración de TP aguas abajo, la represión del potencial funcional de los patógenos asociado con el metabolismo del P (R2 = 0,19, p < 0,001), PPP (R2 = 0,05, p < 0,05), la biosíntesis de fosfolípidos (R2 = 0,22, p < 0,0001 ), y se observó RNR (R2 = 0,31, p <0,0001) a lo largo del canal (Fig. 6C), lo que no logró garantizar las bioactividades normales de adquisición de P, replicación de nucleótidos y formación de membrana, y causó además daño celular limitado por P. . Además de la filtración de P, el aumento de las infecciones virales también podría contribuir a la disminución de patógenos bacterianos, como lo indican los índices de abundancia de virus-patógenos significativamente mayores a lo largo del canal (otoño: R2 = 0,12, p < 0,05; primavera: R2 = 0,25, p < 0,01, figura 6D). Estos resultados enfatizaron los efectos de la depredación viral en la recesión de patógenos bajo limitación de P y proporcionaron evidencia de riesgos reducidos para la salud desde el área de la fuente de agua hasta las áreas receptoras de agua en MR-SNWDC.

Como un caso raro de autopurificación natural del agua descubierto en un sistema acuático a gran escala, la dinámica virus-patógeno demostró el gran potencial de las depredaciones virales al reducir más del 30% de los patógenos transmitidos por el agua en el MR-SWNDC, acompañado de una eliminación casi completa. de los muy preocupantes superpatógenos resistentes a los antibióticos en las zonas receptoras de agua (Fig. 6).

A diferencia de otros ecosistemas acuáticos, el MR-SWNDC encontró limitaciones de P duraderas (TP ≤ 0,02 mg/L y N:P 290:1~405:1) a lo largo del canal según los datos de monitoreo mensual de 2015 a 2021 (Figs. 2A, S5 y datos de origen). Como elemento bioesencial de los genomas [83], la escasez de P afecta los procesos metabólicos de los patógenos y el límite superior teórico del potencial de crecimiento. La proliferación celular normal depende del almacenamiento suficiente de materiales genéticos, es decir, nucleótidos, con la arquitectura de los elementos P (Fig. 7), mientras que la RNR funciona como una enzima clave de la única vía de síntesis de novo conocida para el desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) [84 ], el precursor de ADN esencial para la replicación de nucleótidos. Se descubrió que la cantidad de proteína RNR era directamente proporcional a la tasa de síntesis de ADN y desempeñaba un papel crucial en la regulación de las condiciones de crecimiento celular durante el tiempo de generación de Escherichia coli [85]. La P extremadamente baja puede haber aumentado la disminución de los genes asociados a RNR a lo largo del canal (Fig. 6C) y haber inducido desequilibrios en los grupos de dNTP y aumentos en la mutación del genoma [86]. De hecho, los RNR se han aplicado en el diseño de inhibidores para eliminar infecciones patógenas [87]. Además, la disfunción del genoma también se reflejó en la disminución de la actividad del PPP (Fig. 6C), que redujo el suministro necesario de carbono (ribosa 5-fosfato) para el metabolismo de los nucleótidos [88]. Los peligros adicionales causados ​​por las restricciones de P podrían atribuirse a la pérdida de componentes de la membrana que contribuyen a la malformación celular y a un entorno intracelular distorsionado [20] asociado con la represión de genes limitantes de la velocidad (plsX, plsY) [89] involucrados en la biosíntesis de fosfolípidos. Por lo tanto, la disminución de la disponibilidad de P en el MR-SNWDC afectó en gran medida la viabilidad de los patógenos (Fig. 7) y podría aliviar significativamente los riesgos para la salud inducidos por patógenos desde la fuente de agua hasta las áreas receptoras de agua. El límite rígido del sistema de transferencia de agua impidió en gran medida que contaminantes exógenos y especies patógenas ingresaran al canal, excepto en la temporada de inundaciones, cuando la escorrentía superficial puede introducir ligeras entradas externas, especialmente en el tramo más largo de Reg 2 en el MR-SNWDC.

El MR-SNWDC se originó en el embalse de Danjiangkou, pasó por Henan y la provincia de Hebei y desvió agua hacia los municipios de Beijing y Tianjin. Las bacterias, incluidos los patógenos, actúan como uno de los principales consumidores de nutrientes P en el canal. Algunos genes centrales del metabolismo del P (p. ej., pstS, phoH) facilitan la adquisición de P y proporcionan un flujo de P para otros procesos basados ​​en P asociados con la biosíntesis de azúcares de nucleótidos (PPP), la formación de membranas (biosíntesis de fosfolípidos) y la replicación del ADN (RNR). En el MR-SNWDC con deficiencia de P duradera y rápida decadencia del suministro de P a lo largo del canal, los patógenos muestran la represión de la aptitud ambiental, mientras que los virus mejoran sus infecciones líticas para su supervivencia. La depredación viral provoca la mortalidad de las bacterias para liberar viriones de próxima generación e induce una derivación viral de P intracelular para el recambio de otras bacterias heterótrofas, lo que mantiene fuentes sostenibles de huéspedes listas para la siguiente ronda de infección. La dinámica única de infección entre virus y patógenos bajo restricciones de P provoca la recesión de patógenos y mejora la calidad del agua en las áreas receptoras.

Por el contrario, los virus, como otro competidor por los recursos limitados de P, exhibieron una adaptabilidad y capacidad de supervivencia relativamente fuertes a través de una estrategia de "autoconservación". Más específicamente, los virus en el MR-SNWDC adoptaron sabiamente un tamaño de genoma pequeño, casi la mitad de la longitud promedio de los genomas virales de aguas residuales ricas en P (Fig. 3A), para promover la eficiencia de la utilización del P y minimizar los costos potenciales de replicación de nucleótidos y reparación del ADN (Fig. 3B). Probablemente sólo se mantendrían los materiales genéticos más necesarios para cumplir con los requisitos mínimos para los procesos de modificación postraduccional, como la fosforilación de proteínas [90]. Para hacer frente al posible estímulo de restricción P, los virus necesitan mejorar su estabilidad molecular aumentando la presencia de enlaces de hidrógeno y puentes salinos, lo que se indica mediante un aumento del contenido de GC, así como preferencias de codificación de aminoácidos específicos (Fig. S9). Los virus en un ambiente P-oligotrófico podrían tender a conservar energía limitada, mientras que los virus estresados ​​por el frío [4] tendrían que moverse para producir energía y, por lo tanto, probablemente se adaptarían para aumentar la flexibilidad estructural y el plegamiento de proteínas para promover actividades enzimáticas en condiciones termodinámicamente desfavorables. condiciones.

Los virus en el MR-SNWDC mostraron una forma típica de obtener nutrientes P y energía de las células huésped a través de una infección mejorada (Figs. 6D y 7). La creciente abundancia de RNR codificadas por virus a lo largo del canal (Fig. 5D) facilitó el suministro de sustrato dNTP para la polimerización del ADN de los virus, lo que sugiere una mejora de la capacidad competitiva de los virus en condiciones limitadas por P [91]. La regulación de los genes RNR ayudó a mantener un equilibrio entre el suministro de precursores de ADN y los requisitos de la producción viral. Los virus virulentos predominantes (Fig. 5B) destruyeron las células huésped para la liberación de viriones de próxima generación (Fig. 7), ejerciendo un control de arriba hacia abajo al suprimir la productividad de las poblaciones de huéspedes [23]. La depredación viral eficiente para la eliminación selectiva de patógenos bacterianos ayudó a mejorar la seguridad de la calidad del agua en el canal (Fig. 7). Estudios anteriores evaluaron las contribuciones virales a los grupos biogeoquímicos e indicaron que la lisis alta puede promover efectos de derivación viral al liberar compuestos nutritivos dentro de las células huésped para la reutilización del P [92, 93], que podría ser la única fuente de recambio microbiano bajo restricciones extremas de P [94] . Las estimaciones cuantitativas de las contribuciones relativas de las derivaciones virales al conjunto de P requerirían datos de P más suficientes y modelos biofísicos más rigurosos en el futuro. El reciclaje de P mediado por virus proporcionó retroalimentación positiva para mantener un equilibrio en la riqueza de las comunidades virales, consistente con los resultados experimentales [95] con respecto a la promoción de la producción viral en un ambiente bajo en P. Además, los virus también codificaron un gran repertorio de AMG asociados con el metabolismo de los nucleótidos (Tabla S6), lo que muestra un alto potencial para afectar la biosíntesis del genoma del huésped para promover la autoproliferación [96].

La aparición y transmisión de patógenos ambientales han contribuido a la prevalencia global de enfermedades humanas [97]. Los virus, como depredadores naturales de patógenos bacterianos, pueden infectar a sus huéspedes y causar la muerte de las células huésped a través de ciclos líticos virales, lo que exhibe un gran potencial en el tratamiento de enfermedades inducidas por patógenos. La llamada “terapia con bacteriófagos” [98], capaz de ofrecer tratamientos muy precisos y específicos a través de infecciones virales específicas y una coevolución constante entre virus y huésped, ha tenido éxito en la terapéutica y la acuicultura [99, 100]. A diferencia de la terapia con bacteriófagos dirigidos a nivel de cepa en las prácticas biomédicas (Fig. S18), grandes repertorios de virus acuáticos con diversos espectros de infección podrían lograr simultáneamente la eliminación efectiva de múltiples patógenos bacterianos, lo que es particularmente útil para abordar los nuevos desafíos en la seguridad del agua potable relacionados con brotes de patógenos o diseminación de microorganismos resistentes a los antibióticos [36].

Descubrimos un interesante paradigma natural de terapia con bacteriófagos para mejorar la calidad del agua a través de la dinámica de infección entre virus y patógenos en el proyecto de ingeniería de transferencia de agua más grande del mundo. Además, interpretamos las condiciones necesarias para la aparición de un evento tan raro en el MR-SNWDC, que se extiende a lo largo de 1432 km, en el que la limitación de P se mantuvo durante un período de 7 años (TP < 0,02 mg/L y N:P 290: 1~405:1) y jugó un papel crítico en comunidades virales y bacterianas in situ. Descubrimos que los virus residenciales han desarrollado genomas más pequeños para minimizar los costos de replicación de nucleótidos, reparación del ADN y modificación postraduccional bajo restricciones extremas de P. Además, revelamos las principales fuerzas impulsoras estructurales que mejoran la estabilidad viral en condiciones de agotamiento de P, facilitadas principalmente por un mayor contenido de GC, así como una preferencia de codificación por residuos de aminoácidos asociados con la rigidez de las proteínas. Con un suministro de P decreciente a lo largo del canal, los patógenos bacterianos exhibieron una capacidad debilitada de genes críticos basados ​​en P involucrados en el metabolismo del P, la formación de membranas y la biosíntesis de nucleótidos, lo que muestra una pérdida de aptitud ambiental y una recesión significativa aguas abajo. Nuestro estudio también reveló la estrategia de supervivencia de los virus virulentos para asegurar nutrientes P y energía de las células huésped al mejorar las infecciones líticas y aumentar la abundancia de genes RNR relacionados con la promoción de los ciclos de replicación del ADN nuclear, lo que redujo los riesgos para la salud de los patógenos bacterianos en la RM. -SNWDC. Este estudio proporcionó una vía alternativa para mejorar la calidad del agua a través de la depredación viral natural y destacó la importancia potencial de la autopurificación asociada con las interacciones entre virus y huéspedes en la protección del agua potable y la gestión sostenible de los recursos hídricos.

Los metagenomas de secuenciación sin procesar de MR-SNWDC se han depositado en la base de datos NCBI BioProject con el código de acceso PRJNA881510. Las secuencias virales informadas públicamente de otros ecosistemas utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos IMG/VR (https://genome.jgi.doe.gov/portal/IMG_VR/IMG_VR.home.html). Los datos originales se proporcionan con este documento. Todos los archivos complementarios relacionados y el archivo de datos de origen están disponibles en https://github.com/ChenTianYi99/MR-SNWDC_virus.

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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Clave Nacional de Ciencia y Tecnología (2021YFC3200900) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (51721006, U2240205). También agradecemos al Dr. Alistair GL Borthwick por su ayuda en la edición del idioma.

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Tianyi Chen, Zongzhi Wu, Bingxue Wang y Jinren Ni

Laboratorio de Microbioma Ambiental y Genómica Innovadora, Facultad de Ciencias e Ingeniería Ambientales, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, República Popular China

Tianyi Chen, Zongzhi Wu, Bingxue Wang, Qian Chen, Mi Zhang, Enhang Liang y Jinren Ni

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Tang Liu

Laboratorio Estatal Clave de Protección Ambiental de Todos los Flujos de Materiales en los Ecosistemas Fluviales, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, República Popular China

Qian Chen

Laboratorio estatal clave de ecohidráulica en la región árida del noroeste de China, Universidad Tecnológica de Xi'an, Xi'an, 710048, República Popular China

Mi Zhang

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JRN diseñó la investigación. TYC realizó el trabajo con la ayuda de TL, ZZW, BXW, QC, MZ y EHL. TYC y JRN escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron con ideas, leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Jinren Ni.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chen, T., Liu, T., Wu, Z. et al. Las interacciones entre virus y patógenos mejoran la calidad del agua a lo largo de la Ruta Intermedia del Canal de Desvío de Agua de Sur a Norte. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01481-2

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Recibido: 10 de diciembre de 2022

Revisado: 12 de julio de 2023

Aceptado: 14 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01481-2

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